Kit Mutagenesis yang Diarahkan Situs Cepat

Mutasi situs tunggal atau multi situs yang cepat pada gen target dalam vektor target.

Mutagenesis terarah-situs in vitro adalah metode eksperimental yang penting di berbagai bidang biologi dan kedokteran, yang sebagian besar digunakan untuk memodifikasi dan mengoptimalkan gen target, menjelajahi situs regulasi promotor, serta mempelajari hubungan kompleks antara struktur dan fungsi protein. Kit ini mengadopsi teknologi terdepan saat ini untuk secara langsung melakukan mutasi situs tunggal, mutasi multi-situs serta mutasi penyisipan atau penghapusan pada gen target. Tingkat mutasi mutasi situs tunggal dapat mencapai lebih dari 90%. Selain itu, tidak seperti kit mutasi tradisional yang memerlukan beberapa putaran PCR, sub-kloning dan langkah-langkah lain yang memakan waktu dan tenaga, pengoperasian kit lebih sederhana, dan hanya empat langkah yang diperlukan untuk membangun strain mutan.

Kucing. Tidak Ukuran Kemasan:
44992901 20 rxn

 

 


Rincian produk

FAQ

Tag Produk

Fitur

Sederhana dan cepat: Kit ini mengadopsi teknologi amplifikasi plasmid substitusi non-untai. Hanya perlu 4 langkah untuk mewujudkan transformasi dari galur tipe liar ke galur mutan, tanpa langkah yang memakan waktu dan tenaga seperti beberapa putaran PCR dan subkloning.
Primer efisiensi tinggi: Kit ini mengadopsi prinsip desain primer yang tumpang tindih sebagian, sehingga lebih banyak plasmid mutan dapat diperoleh dengan amplifikasi.
Dapat diterapkan secara luas: Kit tidak hanya dapat melakukan mutasi satu situs, tetapi juga mutasi multi-situs. Itu dapat bermutasi hingga 5 situs.
Kemampuan beradaptasi yang kuat: Kit ini dapat melakukan mutasi langsung pada plasmid dengan ukuran maksimum 10 kb, pada dasarnya mencakup semua plasmid yang umum digunakan.
Tingkat mutasi tinggi: kit ini memiliki fungsi pencernaan ganda template plasmid termetilasi in vitro dan in vivo, memastikan tingkat mutasi yang lebih tinggi.

Pengaturan Reaksi Mutasi Situs dan Program PCR

Untuk mutasi multi-situs primer tunggal, tingkat mutasi akan lebih rendah daripada mutasi situs tunggal karena peningkatan jumlah situs mutasi. Menurut data percobaan kami, ketika jumlah situs mutasi mencapai 5, tingkat positif mutasi akan berkurang menjadi 50%. Oleh karena itu, dalam hal ini, disarankan untuk menambah jumlah klon yang diverifikasi.
Kit ini mendukung mutasi multi-situs multi-primer, sehingga eksperimen mutasi dapat dilakukan secara bersamaan dalam rentang gen yang lebih luas. Batas atas jumlah situs mutasi masih 5.
Disarankan bahwa plasmid kontrol dan primer yang disertakan dalam kit harus diterapkan saat melakukan eksperimen mutasi baru untuk memudahkan analisis masalah eksperimen.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Semua produk dapat disesuaikan untuk ODM/OEM. Untuk detailnya,silahkan klik Layanan yang Disesuaikan (ODM/OEM)


  • Sebelumnya:
  • Lanjut:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    T: Tidak ada pita amplifikasi

    Template A-1

    Templat mengandung pengotor protein atau penghambat Taq, dll. ——Memurnikan templat DNA, menghilangkan pengotor protein atau mengekstrak DNA templat dengan kit pemurnian.

    Denaturasi template tidak lengkap ——Secara tepat meningkatkan suhu denaturasi dan memperpanjang waktu denaturasi.

    Degradasi template ——Siapkan ulang template.

    A-2 Primer

    Kualitas primer yang buruk ——Mensintesis ulang primer.

    Degradasi primer ——Alikuot primer konsentrasi tinggi ke dalam volume kecil untuk pengawetan. Hindari pembekuan dan pencairan berulang kali atau kriopreservasi 4°C jangka panjang.

    Desain primer yang tidak tepat (misalnya panjang primer tidak cukup, dimer terbentuk di antara primer, dll.) -Desain ulang primer (hindari pembentukan dimer primer dan struktur sekunder)

    A-3 Mg2+konsentrasi

    Mg2+ konsentrasi terlalu rendah ——Meningkatkan Mg . dengan benar2+ konsentrasi: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.

    A-4 Suhu anil

    Temperatur annealing yang tinggi mempengaruhi pengikatan primer dan template. ——Kurangi suhu annealing dan optimalkan kondisi dengan gradien 2°C.

    A-5 Perpanjangan waktu

    Waktu perpanjangan singkat——Meningkatkan waktu perpanjangan.

    T: Positif palsu

    Fenomena: Sampel negatif juga menunjukkan pita urutan target.

    A-1 Kontaminasi PCR

    Kontaminasi silang dari rangkaian target atau produk amplifikasi —— Hati-hati jangan sampai mem-pipet sampel yang mengandung urutan target dalam sampel negatif atau menumpahkannya keluar dari tabung sentrifus. Reagen atau peralatan harus diautoklaf untuk menghilangkan asam nukleat yang ada, dan keberadaan kontaminasi harus ditentukan melalui eksperimen kontrol negatif.

    Kontaminasi reagen ——Alikuot reagen dan simpan pada suhu rendah.

    A-2 Perdanar

    Mg2+ konsentrasi terlalu rendah ——Meningkatkan Mg . dengan benar2+ konsentrasi: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.

    Desain primer yang tidak tepat, dan urutan target memiliki homologi dengan urutan non-target. ——Desain ulang primer.

    T: Amplifikasi non-spesifik

    Fenomena: Pita amplifikasi PCR tidak konsisten dengan ukuran yang diharapkan, baik besar atau kecil, atau kadang-kadang terjadi pita amplifikasi spesifik dan pita amplifikasi non-spesifik.

    A-1 Primer

    Spesifisitas primer yang buruk

    ——Desain ulang primer.

    Konsentrasi primer terlalu tinggi ——Meningkatkan suhu denaturasi dengan benar dan memperpanjang waktu denaturasi.

    A-2 Mg2+ konsentrasi

    Mg2+ konsentrasi terlalu tinggi —— Kurangi konsentrasi Mg2+ dengan benar: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.

    A-3 polimerase termostabil

    Jumlah enzim yang berlebihan ——Kurangi jumlah enzim secara tepat pada interval 0,5 U.

    A-4 Suhu anil

    Suhu anil terlalu rendah ——Secara tepat meningkatkan suhu anil atau mengadopsi metode anil dua tahap

    Siklus PCR A-5

    Terlalu banyak siklus PCR ——Kurangi jumlah siklus PCR.

    T: Pita tambal sulam atau noda

    A-1 Primer——Kekhususan yang buruk ——Desain ulang primer, ubah posisi dan panjang primer untuk meningkatkan spesifisitasnya; atau melakukan PCR bersarang.

    A-2 Template DNA

    ——Templat tidak murni ——Memurnikan templat atau mengekstrak DNA dengan kit pemurnian.

    A-3 Mg2+ konsentrasi

    ——Mg2+ konsentrasi terlalu tinggi ——Reduksi Mg . dengan benar2+ konsentrasi: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.

    A-4 dNTP

    ——Konsentrasi dNTP terlalu tinggi ——Kurangi konsentrasi dNTP dengan tepat

    A-5 Suhu anil

    ——Suhu anil terlalu rendah ——Meningkatkan suhu anil dengan tepat

    A-6 Siklus

    ——Terlalu banyak siklus ——Mengoptimalkan jumlah siklus

    Q: Berapa banyak template DNA yang harus ditambahkan dalam sistem reaksi PCR 50 l?
    ytry
    T: Bagaimana cara memperkuat fragmen panjang?

    Langkah pertama adalah memilih polimerase yang sesuai. Taq polimerase reguler tidak dapat mengoreksi karena kurangnya aktivitas eksonuklease 3'-5', dan ketidakcocokan akan sangat mengurangi efisiensi ekstensi fragmen. Oleh karena itu, Taq polimerase biasa tidak dapat secara efektif mengamplifikasi fragmen target yang lebih besar dari 5 kb. Taq polimerase dengan modifikasi khusus atau polimerase kesetiaan tinggi lainnya harus dipilih untuk meningkatkan efisiensi ekstensi dan memenuhi kebutuhan amplifikasi fragmen panjang. Selain itu, amplifikasi fragmen panjang juga memerlukan penyesuaian desain primer, waktu denaturasi, waktu ekstensi, pH buffer, dll yang sesuai. Biasanya, primer dengan 18-24 bp dapat menghasilkan hasil yang lebih baik. Untuk mencegah kerusakan template, waktu denaturasi pada 94°C harus dikurangi menjadi 30 detik atau kurang per siklus, dan waktu untuk menaikkan suhu ke 94°C sebelum amplifikasi harus kurang dari 1 menit. Selain itu, pengaturan suhu perpanjangan sekitar 68°C dan merancang waktu perpanjangan menurut kecepatan 1 kb/menit dapat memastikan amplifikasi efektif dari fragmen panjang.

    T: Bagaimana cara meningkatkan kesetiaan amplifikasi PCR?

    Tingkat kesalahan amplifikasi PCR dapat dikurangi dengan menggunakan berbagai DNA polimerase dengan fidelitas tinggi. Di antara semua Taq DNA polimerase yang ditemukan sejauh ini, enzim Pfu memiliki tingkat kesalahan terendah dan kesetiaan tertinggi (lihat tabel terlampir). Selain pemilihan enzim, peneliti selanjutnya dapat mengurangi laju mutasi PCR dengan mengoptimalkan kondisi reaksi, termasuk mengoptimalkan komposisi buffer, konsentrasi polimerase termostabil, dan mengoptimalkan nomor siklus PCR.

    Tulis pesan Anda di sini dan kirimkan kepada kami