1 unit (U) Aktivitas Taq Platinum DNA Polymerase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menggabungkan 10 nmol deoksinukleotida ke dalam zat yang tidak larut asam pada suhu 74°C dalam waktu 30 menit menggunakan DNA sperma salmon teraktivasi sebagai template/primer.
Kemurnian dengan deteksi SDS-PAGE lebih dari 99%; Tidak ada aktivitas nuklease eksogen yang terdeteksi; Gen salinan tunggal dalam genom manusia dapat diamplifikasi secara efektif; Tidak ada perubahan aktivitas yang signifikan bila disimpan pada suhu kamar selama satu minggu.
Ini memiliki aktivitas eksonuklease 5′-3′ dan aktivitas eksonuklease 3′-5′, dan kesetiaannya berada di sebelah Pfu polimerase. Kecepatan ekstensi Taq Platinum Polymerase lebih cepat dari Pfu polimerase dan efisiensi amplifikasi lebih tinggi. Produk PCR dapat langsung diligasi ke ujung yang tumpul atau diklon dengan vektor TA. Jika efisiensi kloning perlu ditingkatkan, disarankan untuk melakukan pemurnian terlebih dahulu dan menambahkan overhang 3'-dA sebelum kloning ke vektor TA.
Taq Platinum MasterMix satu tabung (Sertifikasi Produk Teknologi Tinggi Nasional)
Taq Platinum MasterMix telah meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas reaksi PCR dan dapat memperkuat template kompleks dengan konten GC tinggi, struktur sekunder dan sejenisnya. Serendah 2 salinan template target dapat diperkuat, memastikan hasil eksperimen yang lebih akurat.
Formula Taq Platinum MasterMix yang unik membuat seluruh sistem reaksi sangat stabil, dan aktivitasnya tidak akan terpengaruh oleh pembekuan berulang atau penyimpanan jangka panjang pada 4°C.
Solusi campuran PCR yang telah disiapkan sebelumnya yang stabil dan efisien dapat membuat operasi cepat dan sederhana, sangat mengurangi intensitas tenaga kerja dan kesalahan pengambilan sampel. Penambah dan pengoptimal PCR berkinerja tinggi juga disertakan dalam campuran, yang mengurangi persyaratan pada kondisi PCR.
Produk ini memiliki sistem yang mengandung pewarna dan bebas pewarna. Produk MasterMix yang mengandung pewarna dapat langsung dielektroforesis setelah PCR, tanpa menambahkan buffer pemuatan.
Ini dapat menggantikan Pfu polimerase untuk memperkuat produk fidelitas tinggi dari templat kompleks seperti genom, dan cocok untuk aplikasi seperti kloning gen ekspresi, mutasi spesifik lokasi dan analisis polimorfisme nukleotida tunggal (SNP), dll.
Tindakan Pencegahan dalam Merancang Primer PCR:
Panjang primer biasanya 20-25 mer. Namun, ketika melakukan PCR fragmen panjang, panjang primer harus ditingkatkan menjadi 30-35 mer.
Tidak ada pasangan komplementer antara dua primer, terutama untuk 3 basa terakhir di ujung 3′.
Konten GC harus 50-60%, dan hindari GC atau AT kaya lokal. Untuk membuat ikatan primer dan template stabil, hindari struktur kaya AT pada ujung 3′.
Hindari primer untuk membentuk struktur sekunder.
Pilih dua primer dengan suhu Tm yang berdekatan satu sama lain.
Perhitungan Nilai Tm Primer untuk PCR:
Bila primer kurang dari 20 mer: Tm=2°C×(A+T)+4°C×(G+C).
Bila primer lebih dari 20 mer: Tm=81.5+0.41×(GC%)-600/L, di mana L adalah panjang primer.
Atur suhu anil pada (Tm-5)°C.
Konsentrasi akhir primer yang sesuai dapat dipilih antara 0,1 M dan 1,0 M. Konsentrasi primer yang terlalu rendah menyebabkan rendahnya hasil produk amplifikasi, sedangkan konsentrasi primer yang terlalu tinggi lebih rentan terhadap amplifikasi non-spesifik. Biasanya, ketika jumlah template DNA besar atau DNA template kompleks (seperti DNA genom manusia) digunakan sebagai template, konsentrasi primer harus lebih rendah. Ketika jumlah DNA cetakan kecil atau DNA cetakan sederhana (misalnya, DNA plasmid, dll.) digunakan sebagai cetakan, konsentrasi primer harus lebih tinggi.
Semua produk dapat disesuaikan untuk ODM/OEM. Untuk detailnya,silahkan klik Layanan yang Disesuaikan (ODM/OEM)
![]() ![]() |
Gunakan DNA genom sebagai template untuk mengamplifikasi fragmen 1 kb. Setelah reaksi PCR, ambil 5 l untuk deteksi elektroforesis. |
Template A-1
Templat mengandung pengotor protein atau penghambat Taq, dll. ——Memurnikan templat DNA, menghilangkan pengotor protein atau mengekstrak DNA templat dengan kit pemurnian.
Denaturasi template tidak lengkap ——Secara tepat meningkatkan suhu denaturasi dan memperpanjang waktu denaturasi.
Degradasi template ——Siapkan ulang template.
A-2 Primer
Kualitas primer yang buruk ——Mensintesis ulang primer.
Degradasi primer ——Alikuot primer konsentrasi tinggi ke dalam volume kecil untuk pengawetan. Hindari pembekuan dan pencairan berulang kali atau kriopreservasi 4°C jangka panjang.
Desain primer yang tidak tepat (misalnya panjang primer tidak cukup, dimer terbentuk di antara primer, dll.) -Desain ulang primer (hindari pembentukan dimer primer dan struktur sekunder)
A-3 Mg2+konsentrasi
Mg2+ konsentrasi terlalu rendah ——Meningkatkan Mg . dengan benar2+ konsentrasi: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.
A-4 Suhu anil
Temperatur annealing yang tinggi mempengaruhi pengikatan primer dan template. ——Kurangi suhu annealing dan optimalkan kondisi dengan gradien 2°C.
A-5 Perpanjangan waktu
Waktu perpanjangan singkat——Meningkatkan waktu perpanjangan.
Fenomena: Sampel negatif juga menunjukkan pita urutan target.
A-1 Kontaminasi PCR
Kontaminasi silang dari rangkaian target atau produk amplifikasi —— Hati-hati jangan sampai mem-pipet sampel yang mengandung urutan target dalam sampel negatif atau menumpahkannya keluar dari tabung sentrifus. Reagen atau peralatan harus diautoklaf untuk menghilangkan asam nukleat yang ada, dan keberadaan kontaminasi harus ditentukan melalui eksperimen kontrol negatif.
Kontaminasi reagen ——Alikuot reagen dan simpan pada suhu rendah.
A-2 Perdanar
Mg2+ konsentrasi terlalu rendah ——Meningkatkan Mg . dengan benar2+ konsentrasi: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.
Desain primer yang tidak tepat, dan urutan target memiliki homologi dengan urutan non-target. ——Desain ulang primer.
Fenomena: Pita amplifikasi PCR tidak konsisten dengan ukuran yang diharapkan, baik besar atau kecil, atau kadang-kadang terjadi pita amplifikasi spesifik dan pita amplifikasi non-spesifik.
A-1 Primer
Spesifisitas primer yang buruk
——Desain ulang primer.
Konsentrasi primer terlalu tinggi ——Meningkatkan suhu denaturasi dengan benar dan memperpanjang waktu denaturasi.
A-2 Mg2+ konsentrasi
Mg2+ konsentrasi terlalu tinggi —— Kurangi konsentrasi Mg2+ dengan benar: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.
A-3 polimerase termostabil
Jumlah enzim yang berlebihan ——Kurangi jumlah enzim secara tepat pada interval 0,5 U.
A-4 Suhu anil
Suhu anil terlalu rendah ——Secara tepat meningkatkan suhu anil atau mengadopsi metode anil dua tahap
Siklus PCR A-5
Terlalu banyak siklus PCR ——Kurangi jumlah siklus PCR.
A-1 Primer——Kekhususan yang buruk ——Desain ulang primer, ubah posisi dan panjang primer untuk meningkatkan spesifisitasnya; atau melakukan PCR bersarang.
A-2 Template DNA
——Templat tidak murni ——Memurnikan templat atau mengekstrak DNA dengan kit pemurnian.
A-3 Mg2+ konsentrasi
——Mg2+ konsentrasi terlalu tinggi ——Reduksi Mg . dengan benar2+ konsentrasi: Optimalkan Mg2+ konsentrasi dengan serangkaian reaksi dari 1 mM sampai 3 mM dengan interval 0,5 mM untuk menentukan Mg optimal2+ konsentrasi untuk setiap template dan primer.
A-4 dNTP
——Konsentrasi dNTP terlalu tinggi ——Kurangi konsentrasi dNTP dengan tepat
A-5 Suhu anil
——Suhu anil terlalu rendah ——Meningkatkan suhu anil dengan tepat
A-6 Siklus
——Terlalu banyak siklus ——Mengoptimalkan jumlah siklus
Langkah pertama adalah memilih polimerase yang sesuai. Taq polimerase reguler tidak dapat mengoreksi karena kurangnya aktivitas eksonuklease 3'-5', dan ketidakcocokan akan sangat mengurangi efisiensi ekstensi fragmen. Oleh karena itu, Taq polimerase biasa tidak dapat secara efektif mengamplifikasi fragmen target yang lebih besar dari 5 kb. Taq polimerase dengan modifikasi khusus atau polimerase kesetiaan tinggi lainnya harus dipilih untuk meningkatkan efisiensi ekstensi dan memenuhi kebutuhan amplifikasi fragmen panjang. Selain itu, amplifikasi fragmen panjang juga memerlukan penyesuaian desain primer, waktu denaturasi, waktu ekstensi, pH buffer, dll yang sesuai. Biasanya, primer dengan 18-24 bp dapat menghasilkan hasil yang lebih baik. Untuk mencegah kerusakan template, waktu denaturasi pada 94°C harus dikurangi menjadi 30 detik atau kurang per siklus, dan waktu untuk menaikkan suhu ke 94°C sebelum amplifikasi harus kurang dari 1 menit. Selain itu, pengaturan suhu perpanjangan sekitar 68°C dan merancang waktu perpanjangan menurut kecepatan 1 kb/menit dapat memastikan amplifikasi efektif dari fragmen panjang.
Tingkat kesalahan amplifikasi PCR dapat dikurangi dengan menggunakan berbagai DNA polimerase dengan fidelitas tinggi. Di antara semua Taq DNA polimerase yang ditemukan sejauh ini, enzim Pfu memiliki tingkat kesalahan terendah dan kesetiaan tertinggi (lihat tabel terlampir). Selain pemilihan enzim, peneliti selanjutnya dapat mengurangi laju mutasi PCR dengan mengoptimalkan kondisi reaksi, termasuk mengoptimalkan komposisi buffer, konsentrasi polimerase termostabil, dan mengoptimalkan nomor siklus PCR.
Sejak didirikan, pabrik kami telah mengembangkan produk kelas dunia pertama dengan mengikuti prinsip
kualitas pertama. Produk kami telah mendapatkan reputasi yang sangat baik di industri dan kepercayaan yang berharga di antara pelanggan baru dan lama..